在動物細胞培養(yǎng)過程中，必須有可以貼附的支持物表面，其依靠自身分泌或培養(yǎng)基中的貼附因子才能在該表面生長增殖的離體動物的培養(yǎng)細胞。那么貼壁細胞培養(yǎng)的步驟有那些呢？讓我們一起來看看吧！

1. 將含有凍存細胞的安瓿放入37℃水浴中解凍。

2. 用70%乙醇對安瓿的頂端進行消毒，打開安瓿，用吸管將細胞轉移到含有5ml起始培養(yǎng)基的25cm2組織培養(yǎng)瓶中，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使細胞均勻分布于培養(yǎng)瓶中，將其放入5%CO2加濕培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。

3. 吸出起始培養(yǎng)基，換成適當?shù)木S持培養(yǎng)基。將細胞放回CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每天檢查細胞是否生長至匯片。

4. 如果細胞生長至匯片，吸出培養(yǎng)基。

5. 用PBS或胰酶/EDTA清洗細胞，除去細胞上殘留的血清，將洗液吸出。

6. 用37℃、適當體積的胰酶/EDTA剛好覆蓋單層細胞（如對于25cm2培養(yǎng)瓶需要0.3ml）。消化30～40s（細胞應該分開），晃動培養(yǎng)瓶使細胞wan全分開。

7. 加入1.4ml適當?shù)木S持培養(yǎng)基，用吸管來回吹打細胞懸液多次以打散細胞團（這些細胞用于傳代）。

8. 吸出0.5mL的細胞懸液，將其加入到新的含有30ml維持培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶中。輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使細胞均勻分布于培養(yǎng)瓶中，將其放入CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)直到細胞生長至匯片（大約1周）。大約間隔一周用維持培養(yǎng)基進行1:20稀釋傳代以維持細胞生長。

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